1．液体配制
A液：血清处理液：（100ml中含下列试剂成份）
MEM 85ml
3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
胎牛血清 2ml
青、链霉素（各10000U/ml） 10ml
B液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列试剂成份）
MEM 85ml
3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
HEPES 1ml
胎牛血清 10ml
青、链霉素（各10000U/ml） 1ml
C液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体）
MEM 93ml
3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
HEPES 1ml
胎牛血清 2ml
青、链霉素（各10000U/ml） 1ml
2．攻击病毒CCID
50滴定和滴度梯度制备
（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于10支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余应高压后废弃；
（2）加Eagle液10倍系列稀释为10
-1至10
-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；
（3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液＋50μl细胞悬液）， 36℃培养7d，观察细胞病变；
（4）按Behrens-Kärber公式计算出分离病毒株的CCID
50；
log CCID
50 ＝ L-d （S-0.5），其中：
L ＝ 实验中使用的最低稀释度的对数值；
d ＝ 稀释梯度的对数值；
S ＝ 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。
（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID
50的病毒载量；
（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100 CCID
50/0.05ml）；
（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的C液）0.9ml；
（8）用带滤芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即100CCID
50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1 CCID
50/0.05ml和0.1 CCID
50/0.05ml。
（CCID
50/0.05ml图略）
3．稀释血清
（1）发病1-3d内采取患者急性期血清，发病后2-4周采取恢复期血清，分别冻存在-20℃备检。
（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56℃、30min灭活。
（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：64），依次至1：1024，血清稀释的过程中不必更换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。
（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。
4．病毒中和抗体测定的操作步骤：
（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1：1024稀释度的待测血清0.05ml，不必更换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1：256稀释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1：64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1：16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1：4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；
（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 CCID
50/0.05ml）；
（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO
2孵箱中孵育2h；（图略）
（4）另取一块96孔板纵向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml，然后从0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存；（图略）
（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×10
5个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；
（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO
2孵箱中孵育培养；
（7）使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 CCID
50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5～7d）；
（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32～320 CCID
50/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。
5．结果判定
当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。
对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CVA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1：256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1：128判定为可疑阳性。
（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。
1．RNA提取
可使用多种商业化试剂盒来提取RNA，针对临床标本应选择质量较高的“用于临床标本病毒RNA提取的试剂盒”，也可使用全自动RNA提取仪进行提取。针对病毒分离物，核酸提取比较容易，大部分商业化RNA提取试剂盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依据使用的试剂不同，严格按说明书进行操作。
2．逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
（1）引物序列合成
国家脊灰实验室自行设计3对引物，分别为人肠道病毒通用引物、EV71特异性引物和CVA16特异性引物。各省CDC依据引物序列在质量有保证的公司合成，引物合成后，需要做预实验，保证引物合成没有质量问题后，分发给地市级CDC。
1）人肠道病毒（包括EV71、CVA16）核酸检测通用引物序列：
PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`
PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`
（图略）
2）EV71核酸检测引物序列：
EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`
EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`
（图略）
3）CVA16核酸检测引物序列：
CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`
CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`
（图略）
（2）实验设计
1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。
2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。
A：阳性对照：参比RNA，省级CDC提供（只是在初次使用，常规不建议使用，以防污染）。
B：阴性对照：使用正常细胞RNA或临床标本肠道病毒阴性的RNA（每次实验要设立）。
C：试剂对照：用去离子水代替标本（试剂初次使用时必须做）。
（3）RT-PCR扩增反应和条件
1）从临床标本或病毒中提取的RNA和各种RT-PCR试剂应该一直放在冰浴盒上；
2）配下列试剂主溶液：
┌─ 10×PCR Buffer········································5.0μl
│ dNTPs（2.5mM each）·····································2.0μl
│ 上游引物（0.1μg/μl）····································1.0μl
│ 下游引物（0.1μg/μl）····································1.0μl
└─RNA酶抑制剂（RNasin，40U/μl）·································0.5μl
Taq DNA聚合酶（5U/μl）···································0.5μl
AMV逆转录酶（10U/μl）····································1.0μl
模板RNA············································3.0μl
RNase Free dH2O··································36.0μl
50.0μl
3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：
42℃························45min
95℃························3min ┐
95℃························20s │
45℃························25s │ ×32个循环
72℃························30s ─┘
72℃························10min
4℃························Soak
3．电泳分析
（1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装置上；
（2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合；
（3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；
（4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35-40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；
（5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向；
（6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，
注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用。溴化乙锭废弃物按医疗废弃物中化学品的有关规定处理。
（7）在蒸馏水中涮一下凝胶；
（8）在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。
有条件的实验室可以使用全自动电泳分析仪。
4．结果解释
使用全自动电泳分析仪的实验室可以通过仪器自动读取PCR产物大小，来判断结果。通过琼脂糖凝胶做PCR产物电泳的实验室，需要参照DNA分子量对照对照，比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。
RT-PCR实验结果解释表
待检标本RT-PCR结果
| 鉴定结果
|
HEV（-）， EV71（-）， CVA16（-）
| 非肠道病毒（NEV）
|
HEV（＋）， EV71（-）， CVA16（-）
| 非EV71、CVA16的其它肠道病毒
|
HEV（＋）， EV71（＋）， CVA16（-）
| EV71
|
HEV（＋）， EV71（-）， CVA16（＋）
| CVA16
|
（四） Real-time RT-PCR （rRT-PCR）
1. 病毒核酸提取
参考常规RT-PCR病毒核酸提取步骤和注意事项。
2. Real-time RT-PCR （rRT-PCR）
依据不同厂家的试剂盒，严格按相应说明书操作和判断结果。有5种试剂盒，分别为One Step Real-time PCR法检测EV71病毒核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法检测CVA16核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法检测肠道病毒核酸（单通道检测）；One Step Real-time PCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）；One Step Real-time PCR法同时检测EV71和肠道病毒核酸（双通道检测）。下面举2个例子来说明单通道检测和双通道检测的操作规程和注意事项。
（1） One Step Real-time PCR法检测EV71病毒核酸（单通道检测）
①反应体系配置：反应体系共25μl，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5μl的RNA模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。
a.从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n＋1配置反应体系（n＝样本数＋1管阳性对照＋1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：
试剂组成
| 1份样品的量
|
荧光RT-PCR反应液
| 12.5μl
|
逆转录酶
| 0.5μl
|
Taq酶
| 0.5μl
|
引物和探针
| 1.5μl
|
H2O
| 5μl
|
b.将上述反应液混匀离心后，按照每管20μL分装于各荧光PCR仪适用的PCR管中。
c.加样：将提取好的样本RNA，分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。总反应体积25μL。
②荧光RT-PCR循环条件设置
程序
| 循环数
| 温度（摄氏度）
| 反应时间（分钟：秒）
|
1
| 1
| 42℃
| 30min
|
2
| 1
| 95℃
| 2min
|
3
| 40
| 95℃
| 10sec
|
60℃
| 35sec
|
60℃时收集荧光信号
|
