③对照设置
阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本，每次实验应设立。
阳性对照：由省级实验室提供EV71阳性核酸（只在评价试剂时使用）
④结果分析条件设定和结果判断
阈值设定
原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。
Ct值≤35.0的样本为阳性。
38.0＞ Ct值＞35.0的样本为临界值。
Ct值≥38.0的样本或无数值的标本为阴性。
（2） One Step Real-time PCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）
双通道可以同时检测EV71和CVA16核酸，在提取核酸后短时间（2.5小时）内检测到标本中是否含EV71或CVA16核酸。
①反应体系配置
反应体系共25μl，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5μl模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。
a.先将试剂解冻，从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n＋1配置25μl反应体系（n＝样本数＋1管阳性对照＋1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：
b.将下述反应液混匀离心后，按照每管20μL分装于适用的PCR管中。
试剂组成
| 1份样品的量
|
荧光RT-PCR反应液
| 12.5μl
|
逆转录酶
| 0.5μl
|
Taq酶
| 0.5μl
|
引物和探针
| 3μl
|
H2O
| 3.5μl
|
c.加样：将提取好的样本RNA，分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。总反应体积25μL。
②荧光RT-PCR循环条件设置
程序
| 循环数
| 温度（摄氏度）
| 反应时间
|
1
| 1
| 42℃
| 30 min
|
2
| 1
| 95℃
| 2 min
|
3
| 40
| 95℃
| 10 s
|
60℃
| 35 s
|
60℃时收集荧光信号
|
③结果分析条件设定和结果判断
阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本。
阳性对照：提取好的阳性核酸作为模板RNA。
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。
Ct值≤35.0的样本为阳性。
Ct值无数值的标本和Ct值≥38.0的样本为阴性样本。
38.0＞ Ct值＞35.0的样本为临界值。
注：荧光PCR同时读取FAM和HEX，进行双通道检测，FAM荧光Ct值为CVA16的结果，HEX荧光 Ct值为EV71的结果。
四、生物安全
根据2006年1月11日
卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》，柯萨奇病毒、埃可病毒、EV71型和目前分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。
操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。
灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。
所有操作应遵守国家相关法律法规。
附表：1．手足口病病例临床标本采样登记表
2．手足口病病例临床标本检测结果登记表
附表1：
手足口病病例临床标本采样登记表
采样单位：
填表人：
填报日期：
联系方式：
编号
| Lab ID
| 姓名
| 性别
| 年龄
| 现住址
| 发病
日期
| 临床诊断
| 标本类型
| 采样日期
|
轻型
| 重型
| 便
| 咽拭子
| 疱疹液
| 血
| 尸检标本
| 其他
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
